炎症性肠病中的层黏连蛋白:既是魔鬼又是天使

2015-02-18 11:00 来源:丁香园 作者:王强
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作为基底膜构成物和上皮-间质联系中间体的层黏连蛋白(lamininsLM)是组织稳态的关键。炎症性肠病(inflammatory bowel diseaseIBD)是一种多因素病理过程,在组织修复、炎症性肠病的固有风险-即进展为癌方面,微环境、尤其是层黏连蛋白发挥了重要作用,但对其了解尚少。

最近Spenle´教授等PLOS one发表文章,首次表明人类炎症性肠病的结肠标本及小鼠结肠炎中LMα1LMα5链特异性、异位性的过表达,伴核内p53同步蓄积。结合该结果,他们通过染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation AssayChIP)提出了一个机制:p53在启动子水平诱导LMα1表达,且在细胞转染试验中通过基因敲除证实了这一点。

为模拟人类疾病,他们在肠道尤其过表达LMα1LMα5的转基因小鼠中通过化学处理(DSS)、结合或不结合致癌物(AOM)诱发出了结肠炎及结肠炎相关的癌。他们得出结论认为:LMα1LMα5高表达,降低DSS诱发结肠炎的敏感性、降低促炎细胞因子。尽管尚在癌前状态,但他们发现LM在两种LM转基因小鼠中通过促进肿瘤性病变的形成而可能有助于肿瘤发生。

此外,他们的结果还表明,胞核内p53LMα1LMα5的相关过表达,保护组织免受炎症侵害。但在突变的情况下,相同的LM分子则有助于炎症性肠病进展为结肠炎相关的癌。本文中的转基因小鼠在研究LM根据微环境不同而调节组织修复、或促癌这一相互矛盾的作用方面是一种新型模型。炎症性肠病的早期,增强基底膜的稳定性及结构正常化可能是个有吸引力的治疗策略。

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1.人类及小鼠结肠炎中,炎性反应触发LMα1/α5的表达及核内p53蓄积。(ALMα5LMα1在正常粘膜(对照组)、炎症性肠病患者结肠内轻度炎性腺体、溃疡细胞体系腺体(Ulcer Associated Cell Lineage glandUACL)周围的表达。炎症性肠病标本中LMα5的免疫着色沿结肠腺体在较深的隐窝处呈强阳性,在UACL处高表达(箭头)。LMα1则仅见于炎症性肠病标本中隐窝底部的基底膜处和UACL处,无炎症区域则无表达,杯状细胞(g)中可见非特异性免疫反应。插图:深部隐窝的较高倍。(B)对照组及DSS处理小鼠结肠冰冻切片中LMα5LMα1的表达。(C)结肠炎性区及炎症性肠病患者UACL处上皮细胞的核为p53阳性,而周围正常隐窝的胞核则仅有少许p53阳性细胞散在于腺体内。(DDSS处理小鼠结肠标本中p53的表达(绿色)及LMα1的表达(红色)。处理后第三天,上皮细胞内大量胞核出现p53免疫表达,而LMα1共染较弱;插图:胞核p53表达放大图。第五天时,p53阳性较弱的腺体周围可见LMα1强表达。(E)示意图总结了正常结肠粘膜(对照组)、炎症性肠病患者结肠中轻度炎症腺体及UACL周围主要类型LM的分布。注意,仅标出了上皮性基底膜的染色情况。e:上皮细胞;lp:粘膜固有层;mm:粘膜肌层;箭头:隐窝底部的异位着色及UACL周围的着色。标尺:人50μm;鼠25μm

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2:上皮细胞中野生型p53通过结合于LAMA启动子而诱导LMα1表达。(AHCT116细胞培养于富含LM-111LM-511的基质中。(左)RT-qPCR定量检测内源性p53mRNAGAPDH为基准),计算出与对照组(塑料平板)的比值。纳入的9个试验(2天者3例,3天者3例,4天者3例)计算均数±标准差。(右)不同情况下HCT116细胞中p53actin的典型免疫沉淀结果。数据表明,底层的LM并未活化内源性p53的表达。(B)不同时间点测定转染了TP53载体后HCT116细胞内LMmRNA表达相对值。RT-qPCR测定其转录水平(GAPDH为基准),计算与对照组载体的比值。数据表明野生型(wild-typewtp53选择性、进行性诱导LMα1mRNA水平升高。(CHCT116细胞(伊立替康处理48小时)免疫荧光染色后对细胞内LMα1进行半定量测定。注意,伊立替康处理组细胞相比未处理细胞来说,细胞内LMα1升高2.3倍(n=15)。(D)两株独立的稳定sh-TP53 HCT116细胞系及一株sh-RNA对照细胞系经伊立替康处理后LMα1 mRNA的表达。48小时后,RT-qPCR测定LMα1 mRNA的相对值(GAPDH为基准)。数据均为与未处理细胞的相对比值(n=3)。p53去除的细胞中,伊立替康无法刺激LMα1的表达。(E)转染野生型或突变型p53后,HCT116细胞中LAMA1 mRNA的相对表达。LMα1 mRNA仅在野生型p53组有活化。(F)该图中,推测p53结合模序(1-6)位于转录位点上游7kb处的LAMA1启动子区及1号内含子的5kb区。(G)染色质免疫沉淀试验。由转染了对照载体(pCMV)或TP53载体(p53)后的HCT116细胞制备染色质。交联的p53-DNA复合物在PCR对假定的p53结合位点扩增后,经IgG(阴性对照)或抗p53抗体(DO11801)免疫沉淀。Input组为免疫沉淀前的染色质。p53结合了7个备选的p53结合位点。*P<0.05**P<0.01***P<0.001

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3.LM保护组织免收炎症侵害。(A-B)结肠组织镜下观(PAS染色)及LMα1LMα5的表达,标本分别为经DSS处理或未处理的普通小鼠、Tg-lama5Tg-lama1小鼠。该图表明两种LM链均异位性表达于转基因动物的腺体隐窝区(箭头),而LMα1的表达因DSS处理而更加弥散了。(C)均经DSS处理的情况下,lama5lama1转基因小鼠(黑色)相比对照组(灰色)小鼠的结肠及直肠Swiss-roll炎性评分(均数±标准差,n=5)。(D)对DSS处理的普通小鼠(灰色)及DSS处理的Tg-lama1DSS处理的Tg-lama5小鼠(黑色)结肠远端蛋白抽提物行ELISA检测,测定其促炎细胞因子水平(均数±标准差,n=6)。数据证实细胞因子的水平与小鼠的应激有关。e:上皮细胞;lp:粘膜固有层;mm:粘膜肌层;胞核为DAPI染色。*p<0.05**p<0.01。标尺:50μm

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4:过表达LMα1的转基因小鼠中,结肠炎相关的肿瘤发生增加。(A)图示AOM/DSSDSS的处理流程。(B)对照组及转基因小鼠,经AOM/DSSDSS处理后形成符合异型增生及原位癌的不同类型病变。相同处理情况下,Tg-lama1小鼠相比对照组来说形成肿瘤的数量更多(AOM/DSS处理7例,*P<0.05DSS处理者7例,*P<0.05)。(C)苏木素-伊红染色示异型增生及原位癌。病变腺体LMα1(红)、LMα5(最下行,绿)强阳性,且核内存在p53(中间一行,绿)。核染色为DAPIe:上皮细胞;m:肌层;s:间质;箭头:基底膜区。标尺:50μm

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5:炎症性肠病及结肠炎相关癌症中,p53在调节LM表达方面的重要作用。Caroline Spenle´教授等提出下述理论:炎症激发p53在胞核内的蓄积,这反而激活了LMα1的表达、及LMα1伴随LMα5在基底膜的沉积。炎症所致的LMα5过表达机制与p53无关。慢性炎性微环境中高表达的LMα1LMα5,可能具有物理屏障的功能,导致如转基因小鼠所表现的那样炎症减弱。不过,慢性结肠炎后致癌背景中的LMα1LMα5高表达可能有助于促进致癌的微环境。

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编辑: 王强

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