非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是导致慢性肝疾病和肝相关的发病率及死亡率常见的原因，它包括非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）两种形式。流行病学调查显示，在西方国家有将近30%的成人和10%的儿童患有NAFLD。此外，研究表明NASH与额外的心血管事件发生，肝脏及肿瘤相关的死亡率增加相关。
迄今为止，FDA没有批准用于NASH的治疗手段。为此，美国食品药品监督管理局（FDA）和美国肝病研究学会（AASLD）举办了研讨会，以讨论NASH治疗临床试验发展的机遇和挑战，来自美国弗吉尼亚大学医学院内科学部的Arun等总结了讨论相关内容撰写了此综述，文章最近发表在Hepatology杂志上。
背景
NAFLD是一种临床组织学综合症，其组织学特点为显著的脂肪变伴有各种炎症，胞浆气球样变和纤维化。按照定义，仅在摄入酒精量极少（＜2-3单位每天）或者未摄入酒精时发生。NAFLD的主要危险因素包括超重，胰岛素抵抗，II性糖尿病，高血压，低水平的高密度脂蛋白和高甘油三酯血症。
NASH的组织学特点是脂肪变性，炎症和胞浆气球样变伴多量的细胞周围纤维化。然而，有些患者即便是有显著的组织学改变但常常无症状或者无特定的症状。此外，只有在发展为肝硬化之前治疗基础疾病才可能避免肝硬化，故缺乏特异性症状或体征对于要在进展为肝硬化之前诊断疾病来说是巨大的挑战。
NAFLD的晚期临床表现可出现黄疸、瘙痒、水肿、腹水、肝性脑病和胃肠出血等症状，反映了终末期肝疾病的出现。此外，NAFLD偶尔可能在有或者无清楚诱发因素的情况下出现亚急性肝衰竭。
迄今为止，尚无成熟的方法可用于区分可能会进展为相关肝脏疾病的患者和不会进展相关肝脏疾病的患者。因此，发展能够鉴别NAFLD高风险患者的诊断方法是研究优先考虑的问题。
临床试验终点的现状和挑战
1、基于症状和功能状态的终点
对于药品的常规审批路径而言，可将临床有意义的症状改变的测量用作主要终点。NASH显著的影响了患者生活质量的多个方面，因此成人和儿童NASH的生活质量相关评分都比健康对照组更低。
然而，很多NAFLD或NASH患者活动能力良好，能够维持工作以及日常活动。因此，需要在控制混杂变量（如肥胖，糖尿病和其并发症）的前提下，展开对NAFLD患者身体和精神障碍的频率和流行进行鉴别研究。
考虑到许多患者的病情并不会进展，故针对该类人群的干预应该是低风险的。但对于会进展为肝硬化的NASH患者，继续发展能够确定高风险人群的诊断方法及对他们进行合适的干预仍十分重要。
NASH一旦进展为肝硬化，肝功能会出现进行性损害，最终会导致多种症状的出现并损害患者的活动能力。此时，将患者的症状和活动能力作为临床终点的可行性较好。此外，在晚期疾病的研究中，对患者活动能力的评估很有价值。
为了评估临床试验的治疗益处，可能会选择或开发明确可靠的临床结局评估（clinical outcome assessments，COA）用于评估肝硬化患者日常的感受和活动能力。但有些症状可能只为患者本人所知，故应该使用明确可靠的患者汇报结局（PRO）进行评估。
对于不能汇报自身情况的患者（如婴幼儿，认知障碍患者），可以用其他的COA（如医生汇报结局或其他观察者汇报结局）评估患者可观察的行为。所有的临床结局评价在应用之前都需要反复的证实，以确保其能明确可靠地反映临床试验中有意义的改变。
在疾病治疗试验中，用于评估代偿期肝硬化患者发生的失代偿事件的结局终点应该具备可测性及客观性等优点。代偿性肝硬化患者发生失代偿事件的比例和NASH患者发展为肝硬化的比例的数据都是已知的，但即便是在肝硬化人群中，仍需大样本量或长期的临床试验来证明在合理的时间跨度范围内事件发生的比例具有显著的统计学差异。
然而，如果治疗效应大或通过增加符合条件的试验人数，都可能潜在地减少试验所需的时间。此外，研究表明招募肝静脉压力梯度＞10mmHg或MELD分数大＞10的患者可以潜在地增加肝硬化人数。
也存在一些对NASH伴肝硬化的患者有意义的其他临床终点，包括住院率，计划外就诊率，以及某些测试的完成率和损失工作天数。这些临床终点结合健康状态改变的终点，可能将为干预的潜在益处提供更广泛的依据。
2、基于“硬临床结局”的终点
（1）存活作为NASH或肝硬化临床试验终点：
全因死亡率长期作为最重要的结局，因此在评估可以导致死亡的慢性疾病（如NAFLD和NASH）的治疗的临床试验中是一个重要终点。肝脏相关的死亡率是全因死亡率的一个组成部分，它和肝癌，腹水及相关并发症，静脉曲张出血，肝性脑病和最终的急慢性肝衰竭的发生密切相关。
众所周知，发生上述任何一种并发症都预示着健康状态的急性恶化以及死亡风险增大。上述并发症都和肝硬化的出现相关，但肝癌是例外，因为它可以由非肝硬化疾病导致。最近的研究支持将近50%的肝细胞癌和缺乏肝硬化期的NAFLD相关。
NASH进展为肝硬化的过程很缓慢，其中15-20%的患者需要数十年才发展为肝硬化。肝硬化是肝脏相关死亡的主要原因，其直接导致了肝脏失代偿及每年将近4%的死亡率。因此，为了证明死亡率的改善，大部分早期NASH患者需要随访长达10-15年。
由于将全因死亡率或肝脏相关死亡率作为临床终点花费过大及随访时间过长，使得其很难用于药物的研发和审批，故未患肝硬化的NASH患者将其作为主要终点不切实际。在已伴发肝硬化的NASH患者中，更易发生失代偿事件和死亡或肿瘤，全因死亡率或肝脏相关死亡率作为临床终点的可操作性也更好，但是仍然可能需要花费相当长的时间。
（2）替代终点
由于NASH患者达到临床结局需要很长时间，以及未能鉴别相关风险人群，使得为早期NASH患者设计临床试验面临的巨大挑战。然而，考虑到进展性NASH对慢性肝疾病造成的巨大负担，发展相关治疗手段及鉴别风险的人群仍是不容逃避的，因此确定能在合理时间内达到及可靠的替代终点很重要。
A.基于组织学的替代终点
某些组织病理学特征提供了可能预示疾病进展的信息，故肝脏组织学现在为追踪NASH的进展提供了最佳的短期方法。NASH与发展为肝硬化及肝脏相关结局风险的持续增加相关，可能与其潜在的炎症及促纤维化通路相关。
基于现有对NASH发病机制的了解，脂肪性肝炎的逆转可能会减少发展为肝硬化的风险，但脂肪变和炎症在纤维化晚期可能减轻。因此，脂肪性肝炎的逆转且无进展为晚期纤维化的证据可作为临床试验的替代终点，主要适用于早期纤维化的NASH患者的2b和3期临床试验。
在最近的一个维生素E治疗NASH的临床试验中，脂肪性肝炎缓解的患者出现纤维化缓解。需要注意的是，由于对于脂肪性肝炎逆转能否真正预测临床益处仍然不确定，为了确定药物的临床益处，最终仍需要结局试验证明脂肪性肝炎的逆转确实能够预测临床结局。
NAFLD活动分数（NAS）的降低也曾用于临床试验的终点，但其价值受到缺乏NAS改变相关数据的限制，同时其只能对晚期纤维化或临床结局进行评分。NAS的优点为定量性及重复性，但其有效性仍受质疑。因此，可以将NAS作为随机对照试验的次级终点以便于检测其有效性。
B.肝硬化的发生作为潜在替代终点
临床研究表明肝硬化发生预示着患者健康状态的显著恶化，因此研讨会上讨论了能否将进展为肝硬化作为临床试验潜在的临床有意义的结局。肝硬化可以使用瞬时弹性成像方法测量，由于该方法为非侵入的方法，故更易为患者接受。已有数据支持肝硬度与失代偿事件、肝癌及死亡等临床结局具有相关性，这将避免在临床试验中进行过度重复的肝活检。
然而，诊断肝硬化的弹性成像或其他非侵入方法在NASH患者中的使用还不成熟，因此需要更多的数据支持此终点用于临床试验。因此，可将这些非侵入测量方法作为现有临床试验的次要的或探索性终点将会为证实这些方法的有效性提供必要的数据。
C.肝硬化患者的临床试验替代终点
在研讨会中，讨论了一些替代方法作为可能预测代偿性肝硬化患者发病和死亡风险可接受的方法，如Child Pugh Turcotte分数（CPT）和终末期肝病模型（MELD）分数，以及肝静脉压力梯度（HVPG）。
Ⅰ.Child Pugh Turcotte分数
CPT最开始用来评估肝硬化患者行门腔静脉分流术后的死亡风险，与1-5年内的死亡风险相关。Child分级为A级到B级的进展准确的测量了患者健康状态的恶化以及死亡风险的上升。但CPT分数也有多点限制：如胆红素5mg/dl和15mg/dl所评定的分数是相同的，但是实际上它们代表不同的健康状态；CPT还包含了评定者的主观因素，可能会造成结局评价的偏倚。
尽管存在上述限制，但它仍然是评估晚期肝病患者1-5年内死亡风险的常用方法。从Child A级进展到B级或CPT评分出现了2分的改变可能是潜在的替代终点，但是可作为临床试验应答标准的精确改变的分数仍然需要进一步研究确定。
Ⅱ.MELD分数
MELD是评价失代偿肝硬化患者短期（3个月）死亡风险的最佳预测指标，其比CPT更敏感，用于决定肝移植的器官配置。MELD客观性好，容易测量，可广泛应用，因此大量证据支持其用于短期死亡风险的评估。
一般代偿性肝硬化的NASH患者的MELD分数较低，但低的MELD分数在预测死亡风险方面不如高MELD分数有力。然而，MELD分数大于10分的患者比低分患者更易出现失代偿和肝病相关的临床结局。
只有在MELD分数大于14分时，才能体现出肝移植的益处，因此MELD分数大于14分常用于肝移植的临界分数。虽然很多其他因素也决定了一位患者是否能够肝移植，但是MELD分数大于或等于14分时可用于临床试验的替代标准，因为它具有和死亡风险及临床结局相关、客观、易测量、敏感和广泛使用的特点。
已有充足的证据证实“需要肝移植”和“死亡”有相关性，故MELD分数可能作为潜在替代终点。由于“需要肝移植”是一个不可逆的发病状态，达到需要肝移植的MELD分数可能是潜在合理的临床试验终点。
Ⅲ.HVPG
HVPG测量了门脉和肝静脉的压力差，据此提供了患者肝脏的血液动力学状态。由于大量文献已证实HVPG与肝脏相关结局的一致性，故其在方法学是成熟的且具有较好的重复性。但其也存在一定的局限性：为侵入性检查以及需要标准化。
HVPG值大于10mmHg时预示出现失代偿肝硬化相关的并发症，同时该值也是“临床显著门脉高压”的临界值。在纳入标准为HVPG值低于10mmHg的晚期纤维化的NASH患者的临床试验中，减少进展为HVPG大于10mmHg的患者的比例是临床治疗的目标，也是潜在的替代主要终点。此外，HVPG从大于10mmHg降到10mmg以下可作为桥接纤维化或晚期肝硬化的NASH患者的临床试验的替代终点。
（3）疾病进展的其他替代终点
定量肝功能检测可作为肝脏完整性和功能储备的标志，为了使它成为可接受的临床试验替代终点，需要进一步研究获得足够多的数据。
NASH临床试验的其他终点
早期临床试验用于评估药物安全性及有效性，为特定药物的进一步开发做指导，故这些试验的终点需要评估包括潜在肝脏毒性在内的治疗安全的传统终点。已有研究证实存在其他终点用于评估早期临床试验（诸如概念验证和剂量范围试验）的有效性。
在NASH，其缓解伴发肝脂肪变的减少，且血清CK18水平可反映了凋亡活动性，故肝脏甘油三酯定量、肝酶学检测和CK18的联合应用对于疾病改变的测定具有客观性、可测量性和敏感性。此外，血清CK18水平用于成人和儿童NASH患者的2b期临床试验中与肝脏组织学的改善相关度较好，但仍需进一步的研究确定其有效性。
疾病早期风险人群的鉴定
NASH临床研究网络分级可区分确诊的NASH和疑诊NASH，但这两种表型是否代表着不同的自然病程以及它们对治疗的结局是否有差异仍然未明。研究数据表明基于脂肪变、炎症和气球样变性或细胞周围纤维化的组织学改变而诊断的脂肪性肝炎与临床结局相关。
此外，若疑诊NASH和确诊NASH的患者都进入同一临床试验，由于两者对给定治疗的结局可能不同，因此需要合适的统计学方法（如随机化分层）用于解释脂肪性肝炎的组织学差异。
一些对患者行多次活检的小型研究提示疾病进展是双向的：一些受试者疾病缓解，而另一些进展。此外，考虑到肝组织活检的抽样变异性，对于其在3-4年范围中鉴定和定量疾病进展的可行性仍待明确。
虽然疾病从1期进展到2期时并不清楚会出现何种临床并发症，但一般认为进展到晚期纤维化或肝硬化代表患者的健康状况的明显恶化。研究数据表明代谢综合征（不仅是2型糖尿病），持续升高的ALT，更高的基线炎症分数，马洛里小体和肝门或门静脉周围的纤维化是进展风险的独立预测指标。另有数据表明超过20%的1b期和2期受试者进展为晚期纤维化，上述数据为早期NASH临床试验提供了策略上的指导。
晚期疾病（3-4期）治疗试验发展途径
对于晚期肝脏疾病患者而言，有两个潜在的治疗靶点，即直接针对脂肪性肝炎或纤维化的治疗。晚期NASH患者在3-4年内出现肝脏相关的不良结局风险很高，此时针对纤维化的治疗试验需要纳入桥接纤维化或肝硬化的NASH患者。
在研讨会上有相关研究者展示的数据支持NAFLD纤维化分数和FIB4（基于年龄，AST，ALT和血小板计数）分数可以预测NAFLD患者的死亡率及肝脏相关结局。在临床上认为MELD分数可以反映整个肝脏的健康状态，当分数大于10分时和代偿期肝硬化患者的肝脏相关结局风险升高有关。
而在针对晚期纤维化和肝硬化患者的试验中，纳入晚期纤维化和HVPG大于10mmHG的患者可作为增加有结局事件患者的比例的方法，该方法可以最大化治疗组和安慰剂组间效应差异。
对于试验设计和临床终点的其他考虑
早期的临床试验尝试提供概念验证的证据，或者确定药物的合适剂量，常利用诸如转氨酶或者疾病的其他生物标志物作为终点。在2b期和3期试验中，可以考虑使用与肝脏相关的结局联系密切的替代终点。其中一个潜在的替代终点是部分患者HVPG值升高到了大于10mmHg，但这需要纳入晚期纤维化和HVPG分数在6-10mmHg的患者。
在需要测量临床肝脏相关的结局的改善的研究中，通过纳入代偿性肝硬化和HVPG大于10mmHg和或MELD分数大于10分的患者可以使得证明治疗益处的能力最大化。FIB4和NAFLD纤维化分数也能用于更可能有不良结局的患者人群中，它们的优点是更容易计算和更有效。
需要注意的是，纯粹的抗纤维化药物用于治疗晚期NASH并不影响脂肪性肝炎的发展。因此，即使抗纤维化药物是有效的，也还要考虑对疾病的发病原进行干预，故 “维持治疗”应该联合应用针对脂肪性肝炎的药物。然而，疾病进展或者复原不仅只反映在纤维化，故仍需要研究证实结局的持续改善对于减少失代偿或肝细胞癌风险的有益影响。
NAFLD儿童人群临床试验
NAFLD在儿童人群中的发生造成了疾病的持续性负担，且NAFLD儿童的肝组织学检查常和成人所见不一致，因此针对儿童的药物开发也有一些特殊的挑战。然而，考虑到疾病在出现临床结局之前有很长一段自然史，当临床结局出现的时候很多儿童并非再由儿科医师诊治。
儿童为易感人群，可能需要对治疗的潜在毒性更多的关注，故需要特定的研究确定药代动力学和疾病开发的最优剂量。在进行疗效的临床试验之前，早期的儿童临床研究应该聚焦于最优的剂量策略。迄今为止，尚无对儿童药物开发最优路径的共识，故研讨会强调了在NASH药物开发的路径中持续对话的必要性。
NASH药物开发中安全相关的问题
对于NAFLD所有时期的药物或生物制剂开发的临床试验都要警惕药物诱导的肝损伤。NASH和2型糖尿病有关，增加了心血管风险和肿瘤相关的死亡，因此在NASH的2b期和3期临床试验中监测LDL和HDL、甘油三酯、以及控制糖尿病显得十分重要。
