DDW 2018 | 肠道微生态与大肠癌研究进展精粹

2018-06-05 22:34 来源:天津医科大学总医院消化内科 作者:刘天宇
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美国消化疾病周(DDW)由美国肝病研究学会(AASLD)、美国胃肠病学会(AGA)、美国胃肠内窥镜学会(ASGE)和消化道外科学会(SSAT)联合主办,是国际消化系统疾病领域规模最大、学术水平最高的会议及展览会。

2018 年 DDW 于 6 月 2 日-5 日于美国华盛顿会议中心举行,本次会议展示了 5000 多篇摘要和数百场关于消化系统疾病研究、医疗和技术方面的讲座。肠道微生态与大肠癌的研究进展依然是目前的研究热点,并有多场演讲及壁报展示关于此话题进行深入探讨,天津医科大学总医院消化内科为大家带来深入报道。

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1、新型致癌细菌厌氧消化链球菌在大肠癌变中的功能研究

来自中国香港中文大学于君教授团队的两项大规模对粪便(N = 128)和黏膜(N = 259)微生物群宏基因组学研究证实肠道微生态失调与结直肠癌(CRC)密切相关,并发现厌氧消化链球菌(P. anaerobius)在 CRC 患者粪便及黏膜中表达水平均明显升高。文章探讨了 P. anaerobius 促进 CRC 发生及进展的潜在分子机制。

研究使用可自发形成肠道肿瘤的 ApcMin/+小鼠,抗生素鸡尾酒处理 2 周,之后进行 P. anaerobius 灌胃 10 周以评估其对促癌作用的影响。在体外研究中,将 P.anaerobius 与结肠上皮细胞 NCM460 和 CRC 细胞系 HT-29 和 Caco-2 共培养,对以上细胞系进行形态学、蛋白相互作用及癌症相关信号通路分析的研究。

与用非致瘤性大肠杆菌处理的小鼠相比,P.anaerobius 处理的 ApcMin +/-小鼠在 17 周龄时显示出更多的肿瘤数量(P<0.001)和肿瘤重量(P<0.01)。与邻近正常组织相比,qPCR 显示小鼠结肠肿瘤组织中富含 P.anaerobius(P<0.01)。P.anaerobius 可通过影响肿瘤浸润免疫细胞促进 CRC 进展。促炎介质和细胞因子,包括 IL-10,IFN-γ和 NF-κB 在 P.anaerobius 处理的小鼠中显著增加(P<0.05),表明它们参与调节炎症反应。体外实验发现 P.anaerobius 可以粘附并侵袭所有三种细胞系。其在 CRC 细胞系中的粘附和侵袭水平较 NCM460 更强(P<0.01)。此外,研究发现 P.anaerobius 表面蛋白与结肠细胞系中的受体蛋白直接相互作用。 RNA-seq 数据显示,P.anaerobius 可以介导整合素β1/α2 信号传导以激活 PI3K/Akt 通路,从而促进细胞增殖。整合素抑制剂可抑制 P. anaerobius 粘附/侵袭以及 P. anaerobius 介导的 PI3K / Akt 信号传导。

P. anaerobius 通过以下途径促进 CRC:1)与结肠上皮细胞直接相互作用,导致 P.anaerobius 黏附、侵袭,以及 PI3K / Akt 致癌途径的激活; 2)通过激活肿瘤浸润免疫细胞调节肿瘤微环境。

2、结直肠癌患者肠道细菌和肿瘤免疫微环境的研究

散发性结肠直肠癌(CRC)是全世界癌症相关死亡的主要原因之一。年轻患者(<50 岁)的 CRC 发病率呈上升趋势,有必要寻找诊断和治疗的新靶点。已知某些 T 细胞亚群与 CRC 预后相关; 即以干扰素-γ(IFN-γ)为特征的 Th1 应答和以白细胞介素-17(IL-17)为特征的 Th17 应答分别与更好或更差的预后相关。特定细菌在小鼠模型中可诱导 IL-17 依赖性致癌作用,表明特定细菌对人 CRC 的重要影响。先前的研究显示 CRC 肿瘤组织与健康人群的微生物群明显不同,并且右半 CRC 肿瘤常见侵袭性细菌生物膜(BFs),然而一部分健康结肠镜检查患者(10%~15%)也显示出生物膜。本研究旨在验证 CRC 患者的 CRC 相关微生物群和结肠黏膜免疫应答密切关联的假说。

使用经过手术的 CRC 患者的肿瘤及正常肠道组织,评估 CRC 相关微生物,并分析组织相关免疫细胞群。在无菌(GF)C57BL / 6 小鼠中进行粘膜免疫实验。

研究确定了一些细菌与 IL-17 +细胞的关系:即,拟杆菌与 CRC 组织中的 IL-17+ T 调节和非 Treg 细胞负相关,而梭杆菌或变形杆菌与增加的 IL-17+细胞相关,厚壁菌处在中间状态。其他物种特异性分析显示,拟杆菌 16S rRNA 扩增子主要定位于 B.dorei 和 B. fragilis。其与 IL-17+肿瘤微环境有强烈的负相关性。将来自 BF+(肿瘤或结肠镜活检)和 BF-(仅结肠镜活检)组织的人粘膜衍生的细菌液接种到 GF 小鼠,发现 BF+活检组织,而不是 BF-活检组织, 在一周后可诱导强烈的 IL-17 和 IFN-γ反应,而 BF+肿瘤接种物仅诱导强烈的 IL-17 应答反应。

以上研究表明,选择细菌群落,甚至物种,可以驱动促致癌和抗致癌结肠粘膜免疫反应。定义这些群落可以为鉴定 CRC 风险增加的个体提供新的方法。

3、具核梭杆菌感染与炎症相关大肠癌的两种分子表型相关:MSI-H 和 MSI-L/EMAST

DNA 错配修复(MMR)基因产物 MSH3 的缺陷导致具有二核苷酸重复的位点处的微卫星不稳定性(MSI-L)水平降低,并且一部分四核苷酸重复序列(EMAST)处微卫星不稳定性升高。前期研究发现人类细胞暴露于促炎细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和/或过氧化氢会触发 MSH3 从细胞核转移至细胞质,导致 MSI-L/EMAST(L/E)。虽然 L / E 与炎症相关,但在 CRC 中诱导 L / E 的炎症信号的起源尚不清楚。相关研究发现具核梭杆菌(F. nucleatum)的感染在 CRC 的肿瘤起始,进展和化疗敏感性中起关键作用。本研究假设由 F. nucleatum 感染引起的炎症可能诱导 CRC 的 L/E,因此检查了 L/E 与原发性 CRC 组织中存在的 F. nucleatum 的量之间的关联。

对 306 名 CRC 患者的肿瘤和邻近正常组织中提取的基因组 DNA 进行分析,测定微卫星不稳定性和 EMAST,定量 PCR 测定 CRC 组织中 F. nucleatum 的量。

研究共鉴定了 38 例 MSI-H(12.4%),63 例 L/E(20.6%)和 205 例微卫星稳定(MSS)CRC(67.0%)。117 例 CRC 患者(38.2%)检出 F. nucleatum 感染。F. nucleatum 在 MSI-H 中检测到的量显著高于在 L / E(P = 0.047)或 MSS CRC 中检测到的量(P <0.0001)。此外,L/E 中 F. nucleatum 的量显著高于 MSS CRC(P = 0.014)。结肠癌中 F. nucleatum 的量显著高于直肠癌(P = 0.029)。多因素逻辑回归分析(根据性别,年龄,肿瘤分期,肿瘤部位和种族进行调整)显示:①与非 MSI-H 相比,F. nucleatum 的感染与 MSI-H 相关(P = 0.013); ②与 MSS 相比,F. nucleatum 的感染与 L/E 相关(P = 0.024)。

研究证实了 F. nucleatum 的感染与 MSI-H CRC 和更近侧部分的 CRC 相关。同时首次进一步证明非 MSI-H CRC 在 F. nucleatum 感染方面具有异质性,并且与 MSS CRC 相比,L / E CRC 与 F. nucleatum 感染显著相关。研究结果提示 F. nucleatum 的感染可能会触发 CRC 祖细胞中的 L/E。

4、大肠癌中肠道病毒的改变

大肠癌患者特异性肠道菌群标志物已被确认,本研究表征分析 74 名 CRC 患者和 92 名对照人群的粪便病毒水平,旨在识别和验证与 CRC 相关的病毒标志物。研究结果发现 CRC 患者中肠道噬菌体群的多样性显著增加,并发现了 22 个类群的区别。重要的是,研究发现 4 个分类标记物的组合与 CRC 患者较差的存活率相关,并独立于肿瘤-淋巴结转移分期和其他临床参数。以上结果揭示了以前从未报道的癌症病毒标志物,这些发现可能揭示了肠道病毒在 CRC 发展中的作用。

5、高脂饮食诱导肠道菌群失衡活化 MCP-1/CCR2 信号轴加剧肠腺瘤恶变

越来越多的流行病学研究及动物实验证实高脂饮食(HFD)是肠癌发生的重要危险因素之一,天津医科大学总医院消化科王邦茂教授团队对 HFD 对肠道菌群的影响及其加剧肠腺瘤恶变的可能分子机制进行了探讨。

研究将 4 周龄 Apcmin/+小鼠分为 HFD 组(60% 脂肪含量)和对照组(常规饮食)。饲养 12 周后收集粪便,焦磷酸测序法分析肠道菌群变化,气相色谱法检测小鼠回盲部粪便短链脂肪酸变化。剩余粪便作为粪便供体进行粪菌移植实验。抗生素鸡尾酒与 HFD 共同处理观察肠腺瘤进展的变化。处死后观察各组小鼠肠道腺瘤数目、大小及分布。HE 染色评价腺瘤病理类型,Ki-67 免疫组织化学染色评价肿瘤细胞增殖水平,TUNEL 法评价肿瘤细胞凋亡。实时荧光定量 PCR、免疫组织化学染色和蛋白质免疫印迹评价单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及其受体 CC 趋化因子受体 2(CCR2)的 mRNA 及蛋白表达。免疫荧光双染法检测肠道肿瘤组织中巨噬细胞表面分子 F4/80 、M1 型及 M2 型巨噬细胞表面分子的表达。

研究发现 HFD 组肠道腺瘤总数及恶变程度较对照组明显增加。HFD 可促进肠道肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。HFD 组小鼠肠道菌群多样性明显降低,致病菌数量增多,益生菌数量明显降低,同时 HFD 组短链脂肪酸(乙酸、丙酸及丁酸)水平较对照组明显下降。HFD 组肠道组织 MCP-1 及 CCR2 的 mRNA 及蛋白表达水平均高于对照组。免疫荧光双染提示 HFD 组巨噬细胞表面分子 F4/80 和 M2 型巨噬细胞表面分子 MR 阳性表达明显增加,M1 型巨噬细胞表面分子 iNOS 阳性表达明显减少;HFD 组小鼠粪菌液可明显促进 Apcmin/+小鼠肠道肿瘤数目增多,并增加 MCP-1 和 CCR2 的 mRNA 及蛋白表达水平加剧肠腺瘤进展;抗生素鸡尾酒处理后可明显抑制 HFD 诱导的肠腺瘤进展。临床研究也发现,HFD 与进展期结直肠肿瘤发生密切相关。HFD 组与普通饮食组相比,肿瘤组织中 MCP-1、CCR2 及 M2 型巨噬细胞表达水平增高。

以上研究表明 HFD 诱导的肠道菌群失衡可活化 MCP-1/CCR2 信号轴募集和极化 M2 型巨噬细胞,进而加剧肠腺瘤恶变。

6、产丁酸菌调节肠道菌群下调 Wnt 通路防治肠癌发生的研究

肠道菌群在肠癌的发生发展中起到关键作用,肠癌患者肠道产丁酸菌丰度明显降低。目前关于补充产丁酸菌对肠癌发生有何影响知之甚少,天津医科大学总医院消化科王邦茂教授团队于本次大会探究了补充产丁酸菌(丁酸梭菌)对肠道菌群结构和肠癌进展的影响及机制。

高脂饮食喂养的 Apcmin/+小鼠以 2.5×108 CFU / 0.3 ml 的剂量灌胃丁酸梭菌(Clostridium butyricum),每周 3 次持续灌胃 12 周。高脂饮食喂养的 Apcmin/+小鼠灌胃无菌磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution,PBS)作为高脂饮食对照组,普通饮食喂养的野生型小鼠灌胃 PBS 作为完全对照组。灌胃 12 周后处死小鼠,收集三组小鼠粪便进行焦磷酸测序检测肠道菌群组成结构,气相色谱法测定肠道短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)含量。分别计数每只小鼠肠道肿瘤数量及大小,对每组小鼠肠道肿瘤负荷进行统计学分析。分离肠道肿瘤组织检测肿瘤细胞增殖及凋亡水平,及肿瘤相关 Wnt 信号通路表达水平。最后分析三组小鼠肠屏障功能及结肠炎症状态。

研究发现与灌胃 PBS 的高脂饮食 Apcmin/+小鼠相比,补充丁酸梭菌的 Apcmin/+小鼠肠道肿瘤负荷明显降低(P < 0.01)。肠道肿瘤负荷高的小鼠可发现明显的肠屏障功能受损及结肠慢性低度炎症(P < 0.05)。补充丁酸梭菌的 Apcmin/+小鼠肠道机会性致病菌丰度明显降低,包括各类产丁酸菌在内的益生菌丰度升高。不仅如此,与两组对照组相比,接受丁酸梭菌灌胃的小鼠盲肠内容物中的 SCFAs 浓度显著升高,且 Wnt 信号通路相关分子表达水平降低。

研究证实补充丁酸梭菌可抑制肠癌发生,其原因可能与调节肠道菌群及抑制 Wnt 信号通路有关。本研究可为产丁酸菌防治肠癌提供实验依据。

点评

随着生活水平的提高,CRC 的发病率和死亡率在全球范围显著增加,也严重危害我国人民的健康。肠道菌群是人体「特殊的功能器官」,其稳态失衡可影响肠道局部及宿主的免疫功能,导致多种疾病的发生。

早在 1990 年有学者将微生态学引入肿瘤研究领域中提出肿瘤-宿主-微生态系统的理念。近年来,肠道菌群失衡与肠道肿瘤发生发展逐渐成为研究热点,饮食对建立何种肠道菌群起到决定性的作用,肠道菌群可随着饮食改变而快速发生变化。高脂饮食可促进 CRC 的发生发展已多见报道,但具体机制有待阐明。

以上研究对肠道微生态失衡与 CRC 的发生发展之间的关联进行了深刻的阐述,临床与基础工作相结合,深度挖掘 CRC 发生的相关分子机制,及具体致病菌种(具核梭杆菌)或益生菌(产丁酸菌)通过何种方式促进或抑制 CRC 进展。

此外,先前的研究多集中于细菌与 CRC 之间的关联,而肠道病毒对 CRC 的影响缺乏报道,以上研究已证实肠道病毒同样与 CRC 密切相关,应引起高度重视。

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编辑: 姚俊华

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