循环游离 DNA 在消化系统肿瘤中的临床应用

2018-08-02 15:00 来源:北京大学肿瘤医院消化内科 作者:张音洁、王晰程
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肿瘤细胞通过坏死、凋亡、分泌向血液中释放的游离 DNA 即为循环肿瘤 DNA(Circulation  tumor DNA,  ctDNA)。ctDNA 保留了肿瘤特异性基因特征和表观遗传学特征,如癌基因和抑癌基因的点突变、拷贝数变异、DNA 甲基化和染色体重排,这一特点促使 ctDNA 成为潜在的生物标记物。

ctDNA 作为液体活检的一种方法,因其操作简便、侵害性小、易于动态监测的优势在消化系统肿瘤应用方面得到了广泛研究。它可以在疾病不同时期发挥作用,协助筛查或早期诊断、术后检测残余病灶及预测复发、晚期患者指导靶向用药、动态监测治疗反应、判断预后,从而实现个体化治疗。

中国发病率前十的恶性肿瘤中,   消化道肿瘤占据五席,且部分瘤种发病率呈上升趋势。因此消化系统肿瘤的早期诊断、疗效预测及改善预后是临床科研工作者的研究重点。传统活检技术在同一病人身上无法反复多次进行,并且不同肿瘤病灶的基因状态和生物学行为存在着明显的异质性。

因此,液体活检技术这一新兴的病理检测手段应运而生。液体活检主要包括循环肿瘤细胞  (Circulation tumor cells, CTC) 、循环肿瘤 DNA (Circulation tumor DNA, ctDNA) 、外泌体  (Exosomes)  、微小 RNA(microRNA,miRNA) 等,主要检测包含血液、唾液、尿液、腹水、胸水、脑脊液在内的体液。本文着重对 ctDNA 在消化道肿瘤方面的临床应用现状和前景进行阐述。

ctDNA 的简述

早在 1948 年,Mandel 和 Métais 首先报道血液中存在片段化的 DNA,即血浆游离 DNA(cell-free  DNA,cfDNA)。1977 年,Leon 等人观察到肿瘤患者的 cfDNA 水平要明显高于健康人群,而在化疗后 cfDNA 水平会降低。

1994 年,科学家第一次在 cfDNA 检测到 KRAS 突变,从而证实这种携带了突变信息的循环 DNA 是来源于肿瘤细胞。ctDNA 是原发肿瘤组织、循环肿瘤细胞、其他器官组织中转移灶通过坏死、凋亡或直接分泌的方式释放到外周血的 cfDNA。其携带了肿瘤的基因变异特征,如突变、插入、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等,这一特点使其成为潜在的生物标志物。

ctDNA 片段大小不等,在 70~200  bp 的小片段至 21000  bp 的大分子内波动,并且比非肿瘤性 cfDNA 大。其数量和性质受到多种因素影响,比如肿瘤负荷大小、肿瘤状态、DNA 的清除及降解机制等。cfDNA 的半衰期从 16 分钟至 2.5 小时不等,其检测技术类型繁多,每种分析方法均有其各自的适用范围,各有利弊。其中主要的是以聚合酶链式反应(polymerase  chain reaction,PCR)或二代测序(next generation  sequencing,NGS)为基础的高敏感性、高通量检测技术,它们可以在血液中大量正常的 cfDNA 中辨别出少量肿瘤 DNA。

以 PCR 为基础的常用检测方法敏感度较高,可达 0.001%~0.1%,包括检测方法有数字 PCR(digital  PCR,dPCR)、微滴式数字 PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、实时定量荧光 PCR(Real-time  PCR,RT-PCR)、BEAMing(beads,emulsion,amplification,and  magnetics),而 NGS 为基础的高通量检测方法可以提供更多基因组学信息,常用的检测方法有全基因组测序、全外显子测序、TAm-Seq(tagged-amplicon  deep sequencing)、Safe-SeqS(safe-sequencing system)等。

ctDNA 在消化系统肿瘤中的应用

ctDNA 在临床实践中具有很大的应用价值,其通过无创、便捷的检测手段,实时监测患者疾病的发展,指导选择治疗策略,弥补了传统病理检测有创、活检组织量小等不足。目前,ctDNA 的检测已在消化系统肿瘤的全程管理中崭露头角,在疾病的不同分期均可发挥作用,具体可归纳为:

· 筛查或早期诊断

针对合并有早期危险因素的患者以有效技术实现早诊早治,可有助于改善预后。多项研究发现肿瘤患者和健康对照组血浆 ctDNA 的水平有统计学差异,例如 Kim 发现胃癌患者 cfDNA 水平明显高于健康对照组,且进展期胃癌患者 cfDNA 水平高于早期胃癌患者。Park 等人得到相似的结果,他们发现胃癌患者 cfDNA 浓度平均为健康对照组的 2.4 倍。

胰腺癌和原发性肝细胞癌中均有同样的结果。但是,现有研究表明 ctDNA 在许多瘤种的晚期患者中 ctDNA 的检测率可高于 85%,但癌症早期患者中则相应的检出率偏低。故仅依靠检测 ctDNA 水平来实现癌症早筛,效果差强人意。一项来自霍普金斯医学院的研究考虑将 ctDNA 检测和蛋白质生物标记物相结合以增加可切除胰腺癌的检测敏感性,并且显示出极高的特异性(99.5%)。

癌变发生过程中的早期事件之一便是表观遗传改变,包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰等。ctDNA 同样可反映癌症患者的表观遗传学特征,并且通过对表观遗传改变的检测可帮助癌症的早期诊断。Lofton-Day 等发现 SEPT9  DNA 甲基化与结直肠癌的发生相关,显示其在结直肠癌早期诊断中的应用潜力。

此后多项国内外临床研究均证实血浆 SEPT9  DNA 甲基化适用于结直肠癌早期诊断,其诊断灵敏度为 79.3%~95.6%,特异性为 84.8%~99.0%。5-羟甲基胞嘧啶(5 hmC)是近来发现的新型表观遗传学标志。最近的研究表明,基于 5 hmC 生物标记物的 cfDNA 检测在结肠直肠癌和胃癌中有高度预测价值,且优于常规的生物标志物,和组织标本 5 hmC 生物标记物检测相差无几。

ctDNA 用于肿瘤早期诊断的另一个难题,即发现癌症相关的突变后,如何确定肿瘤的来源。2017 年美国加州大学圣地亚哥研究团队揭示表观遗传学检测可帮助确定肿瘤发生的位置。该团队发现人体中的每个组织都有其独特的甲基化谱,通过筛查血浆中 cfDNA 的 CpG 甲基化单倍型标签可以实现对癌变组织的定位。该方法对结肠癌的敏感度和特异性均超过 90%。

整体上,目前采用 ctDNA 检测技术对早期癌症患者的诊断依然处于科研探索阶段,作为一些热点突变的初筛和肿瘤组织检测的补充,更加广泛的临床应用还需更多循证医学证据的支持。

· 术后检测残余病灶及预测复发 

ctDNA 半衰期短,仅允许在几个小时的间隔内动态评估肿瘤状态,这种快速清除使 ctDNA 检测可以更加精确地监测肿瘤患者治疗过程中的肿瘤动态和负荷变化,有助于手术切除患者检测残余病灶及预测复发,且往往可提前于传统的影像学检查发现复发。

早在 2002 年就有一项回顾性研究发现经治的 25 例Ⅰ~  Ⅲ期结直肠癌患者中,能 ctDNA 阳性的患者 2 年无复发生存率为 66%,而 ctDNA 阴性的患者则为 100%,最后揭示 ctDNA 检测可提示患者复发风险较高和总生存期较短。另有一项前瞻性研究纳入了 230 例行根治性切除的 II 期肠癌患者,其中 178 例患者未行辅助化疗。有 14 例(7.9%)患者术后检测到 ctDNA 阳性,其中 11 例(79%)中位随访 27 个月后出现复发,而 164 例术后 ctDNA 阴性患者中只有 16 例(9.8%)患者出现复发。

而在接受辅助化疗的患者中,化疗结束后 ctDNA 阳性与较低的无复发生存率 (recurrence-free  survival,RFS) 相关。这个研究团队后续还对 III 期肠癌患者进行了研究,并将研究结果报道于 2018ASCO。最新的研究纳入了 95 例 III 期结肠癌患者,所有患者术后全部接受辅助化疗,其中有 19 例患者术后 ctDNA 为阳性。

研究发现术后 ctDNA 阳性患者的无复发生存率 (recurrence-free  survival,RFS) 显著低于术后 ctDNA 阴性患者。术后化疗 2 个月后,59% 患者的 ctDNA 由阳性转为阴性,这部分术后 ctDNA 转阴的患者有更好的 RFS,而术后 ctDNA 由阴性转为阳性患者 RFS 更低。以上结果均提示 ctDNA 可显示出影像学无法展示出的残留肿瘤情况,并可作为辅助治疗疗效的指标。

ctDNA 水平与肿瘤负荷及分期相关,结合结直肠癌分子特征监测 ctDNA 中特定基因突变位点、异常甲基化和拷贝数变异水平的变化等可用于评价肿瘤治疗效果、微小残留病灶,并作为监测复发和预后评估指标,较现有临床常用的血浆蛋白标志物可能具有更好的灵敏度和特异性。多项研究还显示利用 ctDNA 监测复发能比影像学检查平均提前 10 个月发现复发。

· 指导靶向用药、动态监测治疗反应、判断预后

对于晚期患者来说,主要的治疗策略是以全身系统治疗为主的综合治疗。而在过去的 20 年中,靶向治疗手段蓬勃发展,已在多个瘤种中广泛应用,制定个体化治疗策略是当前精准医疗发展的核心路线。目前,ctDNA 中基因变异信息为基础的肿瘤分子分型能够极大地方便肿瘤个体化治疗的靶点选择。

人表皮生长因子受体-2  (human epidermal growth factor receptor-2,  HER-2) 是目前胃癌靶向治疗研究中最主要的靶点之一。来自本单位实验室的研究对晚期胃癌患者 ctDNA 和配对肿瘤组织中 HER2 扩增的一致性做出分析,结果显示 ctDNA 的 HER2 扩增与肿瘤组织具有高度一致性(91.4%),表明基于 ctDNA 的评估可以部分克服肿瘤异质性,并可成为胃癌 HER2 分析的潜在替代指标。

几项研究报道 KRAS 在组织中的突变状态与结直肠癌患者的 ctDNA 高度一致(78.3%~97%),NRAS 和 BRAF 的突变也是如此。值得注意的是,在一些情况下,基于血液的分析可检测到在手术标本中未检测到的 KRAS 突变。这可能反映了组织活检中遗漏的但被 ctDNA 捕获的肿瘤异质性,并说明了使用组织作为金标准的不足。另一项研究也证实 ctDNA 分析发现更多的突变,通过 ctDNA 分析发现患者 KRAS,NRAS 和 BRAF 突变的比例分别为 59%,11.8% 和 14.4%,而通过肿瘤组织发现的突变的比例分别为 44%,8.8% 和 7.2%。

来自 2018  ASCO 的一项研究为转移性结直肠癌患者靶向治疗前使用 ctDNA 检测功能性基因融合提供了依据。研究选取了未接受抗肿瘤治疗的结直肠癌外周血进行 ctDNA 二代测序,4290 例患者中有 41 例检测到 45 种独特的融合(0.96%),其中,RET(16 例,0.37%)、FGFR3(13 例,0.30%)、ALK(10 例,0.23%)、NTRK1(3 例,0.07%)、ROS1(2 例,0.05%)、FGFR2(1 例,0.02%),4 例患者发生多个基因融合现象,FGFR 基因融合与 RAS 基因突变相关(OR3.5,p = 0.03),全部 NTRK1 基因融合均为 KRAS/NRAS/BRAF 野生型,基因组改变在出现基因融合的患者中更为常见。

研究结果证明基于血浆检测融合基因是可行的。这些少见特殊基因变异的检出为这不到 1% 的患者提供了新的治疗可能。

靶向药物的使用往往会面临着耐药的出现,通过外周血 ctDNA 可以得出循环中肿瘤分子的变化谱。循环基因组的瞬间情况更能代表肿瘤不同区域的异质性,这比组织活检更早地确认和发现治疗耐药性的出现。Misale 等人利用 ctDNA 对西妥昔单抗或帕尼单抗耐药的结直肠癌患者进行分析,结果显示 60% 患者中获得了继发性 KRAS 突变,并且这种改变较影像学检查发现的疾病进展提前了 10 个月。

另一项研究中选取了 28 例予以帕尼单抗治疗的转移性结直肠癌患者,其中 24 例为 KRAS 野生型,通过 ctDNA 检测发现,9 例患者(38%)最初为 KRAS 野生型患者治疗过程中可检测出 KRAS 突变,其中 3 位患者可检测出多种不同形式 KRAS 突变。

克唑替尼是一种有效的 MET 抑制剂,已被证实对 MET 扩增的食管癌和胃癌有效。约 5% 的胃癌患者发生 MET 扩增,然而,克唑替尼治疗不久即发生肿瘤进展。现在有研究通过 ctDNA 对 IV 期胃癌患者接受克唑替尼治疗 2 个月发生耐药分析其分子机制,结果揭示了多重继发 MET 突变、FGFR2 基因相对拷贝数显著增加及其他相关下游信号的突变 [44]。

最近有学者提议将外周血 ctDNA 检测的结果纳入到更新的 TNM 肿瘤分期系统,即「TNMB」分期系统,具有更好的诊断、治疗、预后价值。「B」的定义为未检测到(「B0」)或检测到(「B1」)ctDNA。

Tjensvoll 等分别收集了确诊的胰腺癌患者化疗前和化疗后每个月的血浆样本,连续监测了 14 例晚期胰腺癌患者的血液 ctDNA 的 KRAS 基因变化(存在 KRAS 突变即 ctDNA 阳性),其中在化疗前 ctDNA 阳性的 10 例患者中,其 ctDNA 量的改变和影像学评估呈一致性,特别是有 3 例患者,他们 ctDNA 的变化较 RECIST 疗效评价提前 1-2 个月。

2018  ASCO 也有多个应用 ctDNA 监测治疗反应、预测疗效的研究。胃肠道肿瘤方面,  HERACLES 试验(NCT02476045)证实血浆 HER2(ERBB2)拷贝数可预测 HER2 靶向治疗反应。研究发现 ctDNA 可鉴定 96% 的 ERBB2 扩增的样本,并能准确预测 HER2 靶向治疗的缓解率。基于 HERACLES 和大型临床队列,血浆中 ERBB2 的拷贝数阈值设定为 3 可用来预测从 HER2 靶向治疗中受益的患者。

免疫治疗无疑是最近最火热的研究方向,如何更好地预测免疫治疗的疗效,特别是如何区分免疫治疗的真性进展或假性进展一直是研究者关注的重点。

近来就有研究对使用免疫治疗的黑色素瘤患者连续进行 ctDNA 检测从而区分出免疫治疗的真性进展或假性进展 [50]。研究纳入 125 例接受 pembrolizumab 或 nivolumab 联合或不联合 ipilimumab 治疗的 IV 期黑色素瘤患者,用 RECISIT  1.1 标准及 irRC 标准进行疗效评价,假性进展定义为第一次影像学评估(第 12 周)时肿瘤负荷增加 25%,但在第二次评价中疾病进展没有得到确认。

其中 29 例患者在第一次疗效评价时,疾病出现进展。而真性进展的患者 20 例,假性进展的患者 9 例。这 9 例假性进展患者其中 2 例(22%)患者基线时和治疗后均无法检测到 ctDNA,4 例(44%)患者基线时可以检测到 ctDNA,但治疗后下降到无法检测,3 例(33%)患者 12 周后 ctDNA 浓度下降大于 10 倍。至于 20 例患者为真性进展的患者,其中 18 例(90%)患者 ctDNA 量明显升高。说明动态监测 ctDNA 变化可以识别假性进展的敏感度为 90%,特异性为 100%。尽管这一研究结果是在黑色素瘤患者中进行探索的,但对于消化系统肿瘤方面仍具有一定提示意义。

因此对于不可切除的晚期肿瘤患者来说,ctDNA 可动态监测化疗及靶向治疗的反应及监测耐药,从而及时反应患者的病情,接受治疗的效果,指导医生判断预后及选择更合适的治疗策略。

ctDNA 检测的局限性和面临的挑战

ctDNA 作为液体活检的重要组成部分,在消化系统肿瘤的个体化诊疗的临床实践的不同阶段和方面发挥着越来越重要的作用,应用前景广阔,但发展过程中同样要面对很多质疑和挑战,还有很多问题需要解决。

第一,液体活检检测技术方法种类众多,但是缺乏行业标准,而临床中对于任何一项面向患者的检测技术,无论在特异度、敏感度和检测稳定性都有较高要求。尽管最近开发了非常敏感的技术,但为癌症早期筛查开发可靠的检测仍然充满挑战性。特别是,在广泛的人群中筛查需要精确的特异性。癌症相关的基因突变随着年龄的增长而发生,即使是在其一生中从未发生过癌症的个体也有可能会携带某些特定的突变基因,这可能导致假阳性结果。

第二,现有 ctDNA 检测收费相对比较昂贵,如何改进技术同时降低成本,减轻肿瘤患者经济负担仍需努力。

第三,在将液体活检全面应用到临床的过程中,尚需更多大型临床研究的支持,特别是前瞻性研究。

最近美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理医师学会(CAP)组织了专家委员会,对已发表的 1338 篇临床 ctDNA 检测的论文进行综述性分析,从分析效度、临床有效性及临床效用对 ctDNA 的临床应用做出剖析,文中特别指出通过比较肿瘤组织和血浆中致病突变的一致性时,有很多生物学因素可能影响这种一致性,比如肿瘤类型、肿瘤异质性、组织和血液取样时间、突变为克隆或亚克隆。

文章认为当前还没有可靠的证据证明 ctDNA 对肿瘤动态检测的临床有效性。对于临床期待的 ctDNA 对早期肿瘤的筛查,专委会认为其临床有效性证据相当有限,也没有足够的证据支持 ctDNA 检测对病人预后和花费有改善,总之,这篇文章并不是否定 ctDNA 未来应用的价值, 而更多是给当前大红大紫的 ctDNA 液体活检带来更为理性的分析和思考。

结语与展望

综上所述,在精准医疗背景下,ctDNA 在临床中对不同时期的肿瘤有不同的应用价值,可实现早期筛查、诊断,肿瘤切除后检测残余病灶、监测复发,同时帮助晚期患者更好地选择靶向药、动态监测治疗疗效,进行有效的预后评估以达到治疗效果最大化。液体活检推动了个体化治疗以及精准医疗的的步伐,但目前还需要大规模的前瞻性研究来确定其对不同肿瘤不同分期的有效性和敏感性。

编辑: 张宇萱

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