据世界卫生组织（WHO）统计数据，肝癌是全球第五大常见恶性肿瘤， 每年约有 78 万新发病例，致死率居癌症引起死亡的第二位。其中，85%-90% 的肝癌属于原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）。 在我国，癌症相关死亡中肝癌排名首位且每年有超过 30 万人被诊断为原发性肝细胞癌，其中超过 80% 的肝癌发生与乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染相关。
HBV 感染的主要危害是慢性感染，慢性乙肝患者（CHB）易发生肝纤维化、肝硬化并最终导致肝癌的疾病进程。不经治疗，约 25% 的人感染乙型肝炎 30-50 年最终可发展为肝硬化或肝癌。我们和其他团队的研究表明，HBV 感染相关肝癌中 p53 功能性突变和 PTEN 表达降低是重要的基因事件。然而，目前尚未有相关研究给出直接证据阐明 p53 突变和 PTEN 表达改变与 HBV 感染过程中肝癌形成的关系。
随着强大的基因编辑工具 CRISPR/Cas9 系统近来在多种机体中的成功应用，其在快速肿瘤模型建立上逐渐发挥潜能。我们的研究利用该系统探究了机体 p53 和 PTEN 突变在 HBV 感染背景下肝癌形成中的作用。为了提高基因编辑效率，我们通过在 CRISPR 质粒骨架上额外插入另一向导 RNA（gRNA）表达框构建了可同时靶向敲除小鼠 p53 基因和 Pten 基因的双敲除质粒。通过尾静脉水压动力注射，把双敲除 p53 和 Pten 基因 CRISPR 系统递送到成年 HBV 转基因小鼠肝脏从而使研究机体 p53 和 Pten 突变在 HBV 背景下肝癌形成中的作用成为可能。
我们的研究结果表明，使用该系统诱导 p53 和 Pten 同时突变后 4 个月原发性肝细胞癌即可明显形成。然而，在野生型小鼠对照组以及使用 CRISPR 空载的 HBV 转基因小鼠组在尾静脉水压动力注射 8 个月后仍未发现明显肿瘤形成。通过对形成的肿瘤进行基因突变分析和病理检测，我们进一步发现形成的肿瘤中存在高频率 CRISPR 系统靶向的 p53 和 Pten 功能缺失性突变以及 p53、Pten 蛋白表达降低。同时，由于 Pten 缺失，我们观察到肝细胞明显的脂肪累积。
值得注意的是，实验中 HBV 转基因小鼠敲除 p53 和 Pten 实验组血清 HBV 表面抗原（HBsAg）水平和谷丙转氨酶（ALT）水平比对照组均显著提高，表明了严重肝损伤和肝脏炎症反应。尽管有关 HBV 致病性的研究很多，但 HBV 在肝癌形成中的作用十分复杂。
和其他相关研究发现，HBV 可能通过多途径诱导疾病的产生，包括免疫介导的肝炎导致的机体基因组改变累积，诱导氧化压反应，病毒特异蛋白 HBx 的直接致癌作用以及 HBV DNA 在宿主基因组的整合等。越来越多的研究表明，炎症微环境是慢性 HBV 感染者肝脏恶性转化的重要原因之一。
本研究中使用的 HBV 转基因小鼠模型可以大量表达 HBV 表面抗原并在内质网累积从而诱导肝脏炎症以及最后肝癌的形成。该模型很好地模拟了肝脏炎症、肝细胞增生和肝癌形成的慢性 HBV 病人的疾病进程。同时，和其他风险因素导致的肿瘤相比，HBV 相关肝癌存在较高比例的染色体改变和基因突变，包括 p53 和 Pten 的高频突变或表达改变。这些重要的机体抑癌基因的改变可能在肝癌形成过程中起到重要作用，但此方面仍缺乏很好的系统研究。
本研究人为模拟联合以上 HBV 背景和机体抑癌基因突变两个因素，结果表明不使用任何化学诱导剂，同时敲除 p53 和 Pten 即可在 4 个月时间内诱导成年 HBV 转基因背景小鼠肝脏成瘤。所以我们的研究第一次提供了机体 p53、Pten 突变和 HBV 共同驱使肝脏肿瘤形成的实验证据，同时我们为快速建立 HBV 特征肝癌模型提供了行之有效的方法，也为将来评价 HBV 相关抗肿瘤药物提供了很好的动物模型。
