张戈 张晓伟 邵先玉 陈振华
泰山医学院附属医院消化科, 山东泰安270000
【摘要】目的：探讨Hedgehog信号通路中PTCH1基因及蛋白在食管癌、癌旁组织及正常食管组织中的表达及其临床意义。方法：采用实时荧光定量PCR技术检测40例食管癌及其相应的癌旁组织和10例正常食管组织中PTCH1mRNA的表达，并应用免疫组化技术检测PTCH1蛋白的表达，分析其与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、转移等临床病理因素的关系。结果：食管癌组织PTCH1mRNA的表达为4.75（2.56-9.09），高于癌旁组织0.80（0.4-1.52）和正常组织1（0.592-1.69），P＜0.05，差异有统计学意义。PTCH1mRNA的表达及PTCH1蛋白与食管癌组织类型和病理类型有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小等无关。结论：PTCH1基因和蛋白在食管癌中高表达，与食管癌的发生发展有关，表明在HH信号通路中PTCH1 基因和蛋白可能是诱发食管癌的原因之一，其检测可能成食管癌临床诊断的新标志物或治疗的新靶点。
Clinical significance of PTCH1 gene and protein expression in esophageal cancer tissues
CHEN Zhen-hua , ZHANG Ge,ZHANG Xiao-wei, SHAO Xian-yu
Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 270000,P.R.China
【Abstract】Objective：To investigate the expression of PTCH1 gene and protein about Hedgehog signal in patients with esophageal carcinoma，precancerous tissues and normal tissues. Method: Using the real-time PCR and immunohistochemistry to detect the expression of PTCH1mRNA in 40 cases esophageal carcinoma , the relative tissues and 10 cases normal esophageal tissues, and analyze its relationship with age ，gender，tumor size，degree of differentiation and lymphatic moving.
Result: The expression of PTCH1 gene in esophageal cancer was 4.75（2.56-9.09），which was higher than that of precancerous tissues 0.80（0.4-1.52）and normal tissues 1（0.592-1.69）. The difference was statistically significant（P＜0.05）. The expression of PTCH1 gene and PTCH1 protein is concerned with degree of differentiation and pathological type ,which was not concerned with age ，gender，tumor size and lymphatic moving.The staining depth about PTCH1 protein in esophageal cancer was stronger than that of normal tissue and precancerous tissues，and the staining depth in squamous cell carcinoma was stronger than that in adenocarcinoma. Conclusion:The expression of PTCH1mRNA and PTCH1 protein is high in esophageal tissues，which may be concerned with the development of esophageal carcinoma. So the detection of PTCH1 gene and protein may become a new clinical diagnosis marker in patients with esophageal carcinoma or as a new target in treatment of esophageal cancer.
【关键词】HH信号系统；食管癌；PTCH1基因；RT-PCR;实时荧光定量PCR;免疫组化；
Keywords: Hedgehog signal system; esophageal cancer; PTCH1 gene; RT-PCR; real-time fluorescence quantitative PCR；immunohistochemistry.
食管癌是目前世界上最为常见的十种恶性肿瘤之一, 每年有超过300 000新发病例，预后较差，五年生存率不到10％[1]。早期诊断是目前提高食管癌患者生存率和治愈率的有效方法，食管癌相关的肿瘤标志被认为是早期诊断的有效方法之一。有研究证实，Hedgehog信号通路异常激活与多种实体肿瘤的发生密切相关。本研究通过实时荧光定量PCR检测Hedgehog（HH）信号通路中PTCH1基因和蛋白在食管癌组织的表达，并与正常食管组织和食管癌旁组织进行比较，分析其表达率与食管癌临床病理指标的关系，探讨PTCH1基因在食管癌中作用及可能的发生机制。
1材料与方法
1.1标本来源
收集2010-01-01-2012-01-31我院胸外科手术切除的食管癌及癌旁组织各40例，另经胃镜取正常食管组织10例，所有标本收集后均迅速液氮冻存。所有患者术前均未行放化疗，亦无其他肿瘤，均经病理确诊。40例食管癌中，食管鳞癌34例,食管腺癌6例。
1.2主要试剂和仪器
Trizol RNA提取试剂及Ultra SYBR Mixture （北京康为世纪生物科技有限公司）；Revert Aid TM第一链cDNA Synthesis试剂盒（赛默飞世尔科技公司）；DNA Ladder Marker （上海信然原装生物试剂）；PTCH1和RPLPO引物（上海桑尼生物公司）；DEPC水（上海生工生物工程有限公司）；琼脂糖（生兴生物技术南京有限公司）；荧光定量PCR仪（型号Rotor-gene Q）；鼠抗人PTCH1蛋白单克隆抗体（一抗）（上海文渊阁生物科技有限公司）；兔抗鼠免疫组化试剂盒（上海文渊阁生物科技有限公司）；DAB（上海生工生物工程有限公司）.
1.2方法
1.2.1组织总RNA的提取 取液氮中冻存的癌组织、癌旁组织及正常食管组织约80mg置于玻璃匀浆器中，加入1mL Trizol试剂于匀浆器中，然后迅速匀浆，整个匀浆过程中均置于冰上。再加入200μl氯仿,12000g,4℃，15min离心；取上层水相，加入0.5ml异丙醇，8000g，4℃，10min离心；倒掉上清，75%乙醇，8000g，4℃，5min离心。食管癌组织、癌旁组织和食管正常组织提取RNA后，分光光度计测定稀释50倍的总RNA，取A260:A280比值为1.8～2.0的RNA进行凝胶电泳，并于紫外透射反射分析仪下观察，凝胶成像分析系统摄像。
1.2.2反转录按Revert Aid TM第一链cDNA Synthesis试剂盒说明书进行操作。
1.2.3实时荧光定量PCR PCR反应体系按康为世纪Ultra SYBR Mixture方法进行。
1.2.4 PTCH1mRNA相对定量表达分析采用比较阈值法，通过检测目的基因PTCH1和管家基因RPLPO基因的CT值来计算ΔCT、ΔΔCT、2-ΔΔCT等，探讨不同组织表达的差异。本实验采用相对定量中的比较CT法，以正常食管组织作为基准，来计算食管癌旁组织与癌组织中PTCH1 mRNA 的表达量。比较40例食管癌组织的PTCH1 mRNA的表达量与肿瘤大小、病理类型、有无转移、组织学类型之间的关系，并以正常食管组织的PTCH1 mRNA的表达量为参考指标，
1.2.5免疫组织化学染色采用EnVision二步法进行免疫组化染色观察PTCH1在不同组织中的表达，染色步骤按照说明书进行，采用微波抗原修复，一抗4℃过夜，DAB显色。
1.3结果判断标准
倒置显微镜下观察并拍摄组织染色照片，采用IPP6.0图片分析软件分析并计算每个组织的DAB显色积分光密度值(OD)，以邵建国[2]等一篇题为胰腺癌组织中PTCH蛋白免疫组化检测的文章为判断标准：PTCH1定位于细胞膜上，阳性染色为棕黄色。于光镜下随机计数1000个细胞，计算染色细胞所占的百分比，小于20%为阴性（-），大于20%为阳性，阳性的染色强度分为+（淡黄色），++（黄色），+++（棕黄色）。根据每组阳性及阴性例数的多少比较不同组织PTCH1蛋白表达的多少。
1.4 统计学方法
应用SPSS13.0统计软件包对所得数据进行单因素方差分析，正常组织、癌旁组织、癌组织的ΔCT等数据均采用X±S的形式表示，检验水准α=0.05。
2结果
2.1总RNA鉴定
电泳主要用于检测RNA的完整性，根据凝胶电泳结果显示，至上而下三个条带分别为28、18和5S，三条带显示清晰，说明从食管组织、癌旁组织、癌组织提取RNA具有完整性（图1）。
图1 不同组织总RNA电泳图
Marker： DNA Ladder Marker；1：食管正常组织;2: 食管癌组织;3: 食管癌组织;4: 食管癌旁组织
2.2PTCH1 mRNA 在三种组织的表达
正常组织PTCH1mRNA的表达量为1（0.592-1.69），癌旁组织的表达量为0.80（0.4-1.52），二者比较P＞0.05，差异无统计学意义；癌组织表达量为4.75（2.56-9.09），与正常组织比较，P＜0.05，差异有统计学意义；癌组织与癌旁组织比较，P＜0.05，差异有统计学意义
2.3 PTCH1mRNA与食管癌患者临床病理因素的关系结果（表1）。根据表1结果，PTCH1mRNA的表达与年龄、性别、肿瘤大小、有无转移无关，与食管癌组织类型、病理类型有关，在食管鳞癌中表达高于腺癌，低分化型高于高中分化型。
表1 食管癌组织中PTCH1 m RNA的表达与临床病理参数
| 项目 |
| n | ΔCT | ΔΔCT | 2-ΔΔCT | P值 |
| 年龄 | ≥55岁 | 30 | 7.62±0.54 | -2.18±0.54 | 4.84(3.80-5.90) |
|
|
| ＜55岁 | 10 | 7.68±0.34 | -2.13±0.34 | 4.47(3.14-5.80) | 0.679 |
| 性别 | 男性 | 26 | 7.76±0.38 | -2.04±0.38 | 4.25(3.60-4.90) |
|
|
| 女性 | 14 | 7.40±0.0.60 | -2.41±0.60 | 5.69(3.56-7.84) | 0.069 |
| 肿瘤大小 | 直径＞3cm | 15 | 7.70±0. 57 | -2.11±0.57 | 4.63(3.03-6.24) |
|
|
| 直径≤3cm | 25 | 7.60±0.44 | -2.21±0.44 | 4.83(3.79-5.87) | 0.805 |
| 组织类型 | 鳞癌 | 34 | 7.49±0.42 | -2.32±0.42 | 5.19(4.32-6.06) |
|
|
| 腺癌 | 6 | 8.23±0.16 | -1.58±0.16 | 3.00(2.50-3.50) | 0.017 |
| 病理类型 | 高中分化 | 25 | 7.90±0.36 | -1.91±0.36 | 3.86(3.24±4.48) |
|
|
| 低分化 | 15 | 7.25±0.39 | -2.56±0.39 | 6.09(4.64±7.55) | 0.002 |
| 有无转移 | 有转移 | 8 | 7.76±0.42 | -2.05±0.42 | 4.88(3.90-5.85) |
|
|
| 无转移 | 32 | 7.61±0.51 | -2.20±0.51 | 4.27(2.32-6.21) | 0.538 |
2.4PTCH1蛋白的表达
表2不同食管组织PTCH1蛋白的表达
| 标本组织 | PTCH1蛋白 | 合计 | 阳性 | |||
| - | + | ++ | +++ | |||
| 正常食管组织 | 5 | 4 | 1 | 0 | 10 | 50% |
| 癌旁组织 | 19 | 14 | 5 | 2 | 40 | 52.50% |
| 食管癌组织 | 10 | 9 | 10 | 11 | 40 | 75% |
表3PTCH1与食管癌临床病理参数表
| 项目 |
| 数量 | PTCH1蛋白阳 | PTCH1蛋白阳 | P | |
| 年龄 | ≥55岁 | 30 | 23 | 76.67% | ＞0.05 | |
|
| ＜55岁 | 10 | 7 | 70.00% | ||
| 性别 | 男性 | 26 | 20 | 76.92% | ＞0.05 | |
|
| 女性 | 14 | 10 | 71.43% | ||
| 肿瘤大小 | 直径＞3cm | 15 | 11 | 73.33% | ＞0.05 | |
|
| 直径≤3cm | 25 | 19 | 76.00% | ||
| 组织类型 | 鳞癌 | 34 | 28 | 82.35% | ＜0.05 | |
|
| 腺癌 | 6 | 2 | 33.33% | ||
| 病理类型 | 高中分化 | 25 | 16 | 64.00% | ＜0.05 | |
|
| 低分化 | 15 | 14 | 93.33% | ||
| 有无转移 | 有转移 | 8 | 5 | 62.50% | ＞0.05 | |
|
| 无转移 | 32 | 25 | 78.13% | ||
3 讨论
食管癌的确切病因不明，现认为其发生是多因素共同作用的结果，包括易感因素，遗传因素、环境因素等等。本文主要从基因信号学角度对食管癌进行研究，同时对PTCH1蛋白进行了检测。结果表明：实验所用组织中PTCH1mRNA均有表达，癌组织中表达明显增高，高于癌旁组织和正常组织，癌旁组织和正常组织间PTCH1基因表达无差异；其表达水平在病理类型上食管鳞癌高于腺癌，基因必须通过表达相应蛋白发挥作用，通过免疫组化对蛋白的检测，与PTCH1 mRNA的检测具有一致性；PTCH1 mRNA在组织分化程度上低分化者高于中高分化者，由此可得出食管癌的恶性程度与PTCH1mRNA的表达具有相关性，恶性程度越高，其表达越高;与性别、年龄、有无淋巴转移、肿瘤大小无关（P＞0.05）。
长期以来，研究人员推测与胚胎发育密切相关的信号传导基因在癌变过程中具有重要作用。这一推测首先在对皮肤痣样基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤的研究中得到了证实[3]。HH信号通路主要由分泌型信号糖蛋白SHH配体、跨膜蛋白受体PTCH和另一跨膜蛋白SMO组成的复合物，以及下游转录因子GLI蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)组成【4】。HH信号通路是一个经典的控制胚胎发育的信号传导通路，在哺乳动物中广泛存在，控制细胞的生长与增殖，而肿瘤细胞无限扩增亦是其生长增殖失控的过程。PTCH1作为HH信号通路中一员，定位在9q22·3，其可发生突变、表达变化(表达增高、减低或缺失）、甲基化修饰等，均可引起许多潜在变化，失去对SMO的抑制，激活信号通路，进一步激活靶器官。Anca Oniscu[5]等研究表明HH信号通路参与结肠癌变的过程，且在HH通路中SHH、PTCH和SMO在结肠息肉、结肠腺瘤和结肠癌中的表达量逐渐增加。Nielsen等[6]研究发现在胰管癌组织中PTCH1 mRNA的平均水平明显要高于临近的正常组织。山东大学马晓丽教授等[7]对99例早期胃癌进行研究,发现63例标本中存在PTCH1或GLI的高表达，并应用另外一种药物环靶明（HH信号通路抑制剂）降低PTCH1和GLI表达，可使细胞生长受限乃至凋亡。王树俊[8]等应用免疫组化明确了35例食管癌和癌旁组织中PTCH和SHH的高表达表达，推测PTCH和SHH及HH的激活参与了食管癌的发生，可能是食管癌治疗的一个理想靶点。
PTCH1基因在食管癌中的表达通过本实验得出：（1）在癌组织中表达高于癌旁组织和正常组织；（2）在鳞癌中表达高于腺癌；（3）低分化癌中表达量高于高中分化癌。PTCH1作为HH信号通路中的一员，其表达在食管癌中增高，可能使得与SMO形成的复合体发生改变，继而诱发HH信号通路异常激活有关，这可能是引起食管癌的机制之一，其检测有可能成为新的临床诊断食管癌的标志物或者治疗食管癌的新靶点。
参考文献
[1] Stathopoulos GP, Tsiaras N. Epidemiology and pathogenesis of esophageal cancer : management and its controversial results. OncolRep,2003,10(2): 449- 454.
[2] 邵建国，许国铭，屠振兴，等，胰腺癌组织中PTCH蛋白免疫组化检测[J].第二军医大学学报，2005,26（8）：950-951.
[3] Scales S, de Sauvage F Mechanisms of Hedgehog pathway activation in cancer and implications for therapy. Trends Pharmacol Sci ,2009,30: 303–312.
[4] Ruiz I,Altaba A.Therapeutic inhibition of hedgehog-GLI signaling in cancer: epithelial，stromal，or stem cell targets? [J]. Cancer Cell ，2008, 14(4): 281-283.
[5] Anca Oniscu, Roberta M James, Robert G Morris, Scott Bader, Roger DG Malcomson and David J Harrison.Expression of Sonic hedgehog pathway genes is altered in colonic neoplasia[J].Journal of Pathology,2004;203:909-917.
[6] Nielsen S K,Mollgard K,Clement CA,et al.Characterization of primary cilia and Hedgehog signaling during development of the human pancreas and in human pancreatic duct cancer cell lines[J].Dev Dyn,2008,237(8):2039-2052.
[7] Xiaoli Ma,Kai Chen,Shuhong Huang,Xiaoli Zhang,Patrik A.Adegboyega,B,Mark
Evers,Hongwei Zhang and Jingwu Xie.Frequent activation of the hedgehog pathway in advanced gastric adenocarcin omas [J].Carci nogens is,2005,(26):1 698- 1705.
[8] 王树俊，张剑，裘宋良，等，Shh 和Ptch 在食管鳞状细胞癌中的表达研究[J]. 基础和临床肿瘤学杂志,2006,3(19):172-174.
