siRNA“突破”并“攻入”

2011-01-10 00:00 来源:美国GeneCopoeia(复能基因) 作者:
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 要使siRNA能够真正应用到临床,成为一项治疗措施,首先就需要保证能将它们送达目的细胞和组织。目前主要有两种方法,一种是不依赖病毒的递送方法,将人工化学合成的siRNA分子直接注入体内;另一种是利用基因工程病毒,即利用编码shRNA基因的病毒感染细胞在胞内转录、生成siRNA。

1. 不依赖病毒的递送途径

siRNA分子的大小和负极性特点都让它很难穿透细胞膜。,因此如何将它们送达指定部位是困扰RNA干扰疗法的一大难题。迄今为止已经开发出了多种递送方案,比如直接将RNA分子注入肺、眼等器官,或者以纳米颗粒、包被阳离子、胆固醇基团或者细胞表面受体为载体将RNA注入器官。目前这些方法都已经在鼠类和非人类的灵长类动物模型上进行过实验,图2将向您详细介绍这些方法。


图2 各种治疗性siRNA体内递送机制

a、将胆固醇分子结合到被修饰的siRNA分子上,可以增强它们的稳定性。最常用的siRNA修饰方法是结合了磷硫酰键的2?-O-甲基尿苷(2?-O-methyluridine)或2?-氟尿苷(2?-fluorouridine),即图中蓝色小圆球。

b、多聚阳离子纳米颗粒可以通过其表面与靶细胞上某个受体结合的配体,比如转铁蛋白等直接将siRNA分子递送到特定靶细胞上。

c、SNALP颗粒方法是将修饰过的siRNA包裹进一个阳离子或中性脂质双分子层颗粒中,这个颗粒上还结合了可扩散的聚乙二醇(PEG)脂质分子结合物。这种SNALP颗粒将siRNA递送至细胞,随后siRNA会被内体系统降解、释放出小RNA分子。

d、MEA动态多聚颗粒(MEA-DPC)与SNALPS颗粒比较相似,只不过体积更小一些,而且还含有配体分子能帮助颗粒到达特定的靶细胞。MEA-DPC颗粒上还加入了对PH值不稳定的化学键,因此更有利于内体系统释放siRNA分子。

e、使用鱼精蛋白或其它阳离子物质将特异性的抗体结合到siRNA分子上,这样也可以将siRNA分子递送到特定的靶细胞。f,化学连接或在siRNA转录时加上RNA配体分子也可以将siRNA分子递送到特定的表达该配体受体分子的靶细胞伤。

端胶原(atelocollagen)和聚氨基葡萄糖(chitosan)这两种多聚分子也曾被人试用过。聚氨基葡萄糖具有粘膜粘着特性,它曾被用于siRNA分子经鼻腔吸入到细支气管上皮细胞实验中。在小鼠和非人类的灵长类动物模型上已经证实,这是一种非常有效的siRNA递送方式,可以完全阻断呼吸道合胞病毒对动物上呼吸道的感染。实际上,这种经粘膜的递送似乎是一种非常有效的方法。比如,阴道内注入脂质包被的专门靶向HSV-2病毒的siRNA就能有效地保护实验小鼠,使超过三分之二的小鼠免受这种致命病毒的侵害。

使用粘膜活性多聚物(membrane-active polymer,这种多聚物可以一直不发挥活性,直至进入内涵体才会表现出活性)向肝脏内递送靶向APOB蛋白和PPAR-α蛋白的siRNA分子也获得了成功,用这种方法只需简单的静脉注射就能将siRNA分子递送到肝细胞。还有一种递送方法使用的是转铁蛋白和环糊精多聚阳离子聚合物(transferrin conjugated to a cyclodextrin-polycation polymer)。在小鼠试验中,这种方法可以借助转铁蛋白受体递送靶向尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)Ews–Fli1融合mRNA的siRNA分子,从而成功抑制肿瘤扩散。在小鼠动物模型中还发现,如果将特异性靶向APOB蛋白的siRNA与胆固醇基团结合,则能够将其递送至肝内和空肠(jejunum),抑制APOB基因的表达,降低血脂水平。

最近,在siRNA递送方面取得了一项重大进展,就是成功使用了包被有聚乙二醇(PEG)聚合物链,即SNALP的稳定的核苷酸脂质颗粒(nucleic-acid lipid particle)。在试验中,使用这种脂质颗粒递送系统将靶向针对APOB基因mRNA的siRNA分子递送到了非人类灵长动物的肝脏内。使用这种方法一次静脉注射后基因沉默的疗效就可以持续11天,沉默效率超过了90%,而且不会发生毒性反应。这项激动人心的成果进一步增强了我们使用siRNA治疗肝脏疾病的信心。

直到最近,绝大部分体内的小RNA递送方法还都只是针对特定的器官,比如眼部、肺或肝脏。最近又有人报道成功地将小RNA分子定向递送到了一种参与肠道炎症反应的粒细胞内。在这项实验中,针对细胞周期蛋白D1基因的siRNA被结合到了稳定的纳米颗粒上,这个纳米颗粒表面结合了一种能够特异性识别该粒细胞表面受体的抗体。在小鼠实验中发现,使用这种方法也能有效下调粒细胞内细胞周期蛋白D1基因的表达水平、抑制粒细胞的增殖,并逆转人工诱导的小鼠结肠炎病程。

目前,要有效地将siRNA分子递送至神经系统细胞面临着许多挑战。众所周知,血脑屏障的存在令siRNA分子尤其难以被传递至大脑。不过,有研究发现,直接将siRNA注入大鼠脑内可以使siRNA分子到达外周神经系统,缓解实验动物的慢性疼痛或焦虑症状。还有人在鼠类动物试验中将siRNA分子与脂质体、抗体或神经肽结合,尝试用这些方法将siRNA递送到大脑组织里。不过,上述方法都没有特异性地针对某种神经元细胞,而且都使用了令“人”痛苦的颅内直接注射方式,这些都是需要我们进一步攻克的难题。

最近,有一项研究使用了全身静脉注射(systemic intravenous injection),让我们看到了siRNA分子能够被递送到中枢神经系统的可能性。在这项实验中使用的siRNA是针对日本脑炎病毒的小RNA分子。这些siRNA分子上连接了狂犬病毒糖蛋白短肽,从而可以与神经元细胞上的乙酰胆碱受体结合。静脉注射之后,有80%的实验小鼠在感染日本脑炎病毒后都能继续存活,而未给药对照组则全部死亡。

另一种比较有趣的siRNA递送方法则是使用鱼精蛋白和抗体的融合蛋白(protamine–antibody fusion protein)。具体方法就是将鱼精蛋白和HIV-1包膜蛋白gp160(HIV-1 ENV gp160)抗体的Fab链结合。带正电荷的鱼精蛋白结合了带负电荷的靶向HIV病毒gag基因的siRNA之后,就能选择性地将这些小RNA分子递送到细胞表面表达有gp160蛋白的细胞。在鼠类动物模型试验中发现,这种siRNA抗体复合物到达细胞表面后会被细胞内摄作用吞入,释放出siRNA,下调HIV病毒gag基因的表达。在同一项试验中还发现,如果将结合的抗体换成特异性识别激素受体ERBB2的抗体,则可以将siRNA分子特异性地递送到表达ERBB2受体的肿瘤细胞里。

还有一种类似的特异性递送技术使用的是配体——siRNA嵌合分子。这些配体分子都是在体外合成的核酸分子,能够高选择性地与体内的某些特定分子结合。有人设计了一种专门结合前列腺特异性膜抗原PSMA(又称FOLH1)的RNA配体分子,将其连接到靶定PLK1基因的siRNA分子上,这样就能高选择性地将siRNA递送到前列腺癌细胞当中发挥治疗作用。在小鼠异种移植前列腺癌动物模型试验中发现,肿瘤内注射这种靶定PSMA–Plk1基因的siRNA或靶定PSMA–Bcl2基因的siRNA都可以诱导肿瘤细胞出现凋亡、生长抑制以及肿瘤消退等现象。

还有一种方法是将siRNA与结合了维生素A的脂质体分子连接,这样能够成功地将抗纤维化siRNA分子递送到肝星状细胞(hepatic stellate cell)。在这项大鼠试验中,人们使用多个针对胶原伴侣分子编码基因的siRNA可以成功地逆转肝纤维化进程,增加实验动物的存活率,因为这些siRNA分子能够阻止胶原沉着。这项研究将有望帮助我们攻克肝硬化顽症。

另外,还要重点介绍的是,最近有报道称研究人员构建了一个脂质样分子文库,它可用于为不同的组织筛选合适的siRNA递送方法。

2. 病毒递送途径

还有一种启动RNA干扰的方法就是借助载体启动子表达的siRNA分子。这些siRNA分子都是shRNA分子或类似于miRNA分子的前体物质处理之后生成的。通常,我们都将编码这些发夹结构前体分子的序列插入到病毒载体当中,在PolII或PolIII启动子的操控下表达。使用这种病毒载体的一大优势就是,一次给药之后能获得长期的RNA干扰疗效。这种方法尤其适用于病毒感染导致的慢性疾病,比如艾滋病或病毒性肝炎等疾病的治疗。

目前,病毒载体方法取得了很多成功。但即便如此,我们也应该意识到,某些非致病性的病毒载体仍然具有潜在的免疫原性。此外,使用病毒载体还存在一大问题,那就是存在病毒序列突变的可能。这会造成载体插入宿主细胞基因组后,导致宿主基因突变,诱发异常的基因表达。不过,病毒载体也有其优势。它们能转导分裂细胞和非分裂细胞,长期表达shRNA疗效分子,大大减少用药量。最后,还要强调的就是,任何小RNA分子如果被大量表达都有可能导致毒性反应和免疫反应的发生。

因此,我们在选择递送方式时需要考虑小RNA分子的耐受性、长期表达效率、有效性、特异性以及基因沉默效果等情况。没有一种递送方式是适合所有情况的,我们需要为每一种情况“量身定制”一种最佳的递送方式。

编辑: 莉莉

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